Prevalence of antifolate drug resistance markers in Plasmodium vivax in China / 医学前沿

The dihydrofolate reductase (dhfr) and dihydropteroate synthetase (dhps) genes of Plasmodium vivax, as antifolate resistance-associated genes were used for drug resistance surveillance. A total of 375 P. vivax isolates collected from different geographical locations in China in 2009-2019 were used to sequence Pvdhfr and Pvdhps. The majority of the isolates harbored a mutant type allele for Pvdhfr (94.5%) and Pvdhps (68.2%). The most predominant point mutations were S117T/N (77.7%) in Pvdhfr and A383G (66.8%) in Pvdhps. Amino acid changes were identified at nine residues in Pvdhfr. A quadruple-mutant haplotype at 57, 58, 61, and 117 was the most frequent (57.4%) among 16 distinct Pvdhfr haplotypes. Mutations in Pvdhps were detected at six codons, and the double-mutant A383G/A553G was the most prevalent (39.3%). Pvdhfr exhibited a higher mutation prevalence and greater diversity than Pvdhps in China. Most isolates from Yunnan carried multiple mutant haplotypes, while the majority of samples from temperate regions and Hainan Island harbored the wild type or single mutant type. This study indicated that the antifolate resistance levels of P. vivax parasites were different across China and molecular markers could be used to rapidly monitor drug resistance. Results provided evidence for updating national drug policy and treatment guidelines.

PCR-RFLP Based genetic diversity of Plasmodium vivax genotypes in district Mardan, Pakistan / Diversidade genética baseada em PCR-RFLP de genótipos de Plasmodium vivax no distrito de Mardan, Paquistão

Plasmodium vivax is the most common human malaria parasite in Asian countries including Pakistan. Present study was designed to explore the genetic diversity of plasmodium vivax genotypes based on Pvmsp-3α and Pvmsp-3ßgenes using allelic specific nested PCR and RFLP assays markers from field isolates in district Mardan, Pakistan. Blood samples of 200 P. vivax malarial patients were collected after taking their written informed consent. Genetic diversity in nested PCR products was determined by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizing Alu1 and PstI restriction enzymes for alpha and beta gene products digestion, respectively. For analysis the genetic diversity of the sub allelic variants of Pvmsp3α and Pvmsp3ß genes, Chi-Square test was performed by utilizing Minitab programming software 18. The P value 0.05 was considered as statistically significant. For Pvmsp3α genes after gel electrophoresis of digested products, four distinct genotypes were obtained from total of 50 samples; type A: 35 (70%) (1.5-2.0 kb), 12 of type B (24%) (1.5-1.7 kb), 2 of type C (4%) (0.5-1.5) and one for type D (2%) (0.5-0.65 kb) which could be characterized into 9 allelic pattern (A1-A4, B1-B3, C1, D), in which A3 remained the most predominant. For Pvmsp-3ßgenes, three distinct genotypes were obtained from 50 samples; 40(80%) of type A (1.5-2.5 kb), 9 (18%) of type B (1.0-1.5kb) and 1(2%) of type C (0.65 kb) which could be characterized into 6 allelic patterns (A1-A3, B1-B2, and C1). Most dominant one in Type A was A1 alleles which were noted (46%), while in Type B, the most dominant were B1 (10%).This study is the first ever report of molecular epidemiology and genetic variation in Pvmsp-3α and Pvmsp-3ß genes of P. vivax isolates by using PCR/RFLP from District Mardan and showed a remarkable level of genetic diversity in the studied genes of circulating parasites in the study area. The results of this study will contribute in future studies about the genetic structure of parasite and vaccine development against the malaria.

O Plasmodium vivax é o parasita da malária humana mais comum nos países asiáticos, incluindo o Paquistão. O presente estudo foi desenhado para explorar a diversidade genética de genótipos de Plasmodium vivax baseados nos genes Pvmsp-3α e Pvmsp-3ß, usando marcadores de ensaios alélicos nested PCR e RFLP de isolados de campo no distrito de Mardan, Paquistão. Amostras de sangue de 200 pacientes com malária por P. vivax foram coletadas após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. A diversidade genética em produtos de PCR nested foi determinada por polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) utilizando as enzimas de restrição Alu1 e PstI para a digestão dos produtos dos genes alfa e beta, respectivamente. Para análise da diversidade genética das variantes subalélicas dos genes Pvmsp3α e Pvmsp3ß, o teste Qui-quadrado foi realizado utilizando o software de programação Minitab 18. O valor P = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para os genes Pvmsp3α, após eletroforese em gel de produtos digeridos, quatro genótipos distintos foram obtidos de um total de 50 amostras; tipo A: 35 (70%) (1,5-2,0 kb), 12 do tipo B (24%) (1,5-1,7 kb), 2 do tipo C (4%) (0,5-1,5) e um para o tipo D (2%) (0,5-0,65 kb), que podem ser caracterizados em nove padrões alélicos (A1-A4, B1-B3, C1, D), em que A3 permaneceu como o mais predominante. Para Pvmsp-3ßgenes, três genótipos distintos foram obtidos a partir de 50 amostras; 40 (80%) do tipo A (1,5-2,5 kb), 9 (18%) do tipo B (1,0-1,5 kb) e 1 (2%) do tipo C (0,65 kb), que podem ser caracterizados em seis padrões alélicos (A1-A3, B1-B2 e C1). Os mais dominantes no tipo A foram o alelo A1, observados em 46%, enquanto, no tipo B, os mais dominantes foram B1 (10%). Este estudo é o primeiro relato de epidemiologia molecular e variação genética em Pvmsp-3α. Os genes Pvmsp-3ß de isolados de P. vivax utilizando PCR/RFLP do Distrito Mardan mostraram um nível notável de diversidade genética nos genes estudados de parasitas circulantes na área de estudo. Os resultados desse estudo contribuirão em estudos futuros sobre a estrutura genética do parasita e o desenvolvimento de vacinas contra a malária.

PCR-RFLP Based genetic diversity of Plasmodium vivax genotypes in district Mardan, Pakistan / Diversidade genética baseada em PCR RFLP de genótipos de Plasmodium vivax no distrito de Mardan, Paquistão

Plasmodium vivax is the most common human malaria parasite in Asian countries including Pakistan. Present study was designed to explore the genetic diversity of plasmodium vivax genotypes based on Pvmsp-3α and Pvmsp-3βgenes using allelic specific nested PCR and RFLP assays markers from field isolates in district Mardan, Pakistan. Blood samples of 200 P. vivax malarial patients were collected after taking their written informed consent. Genetic diversity in nested PCR products was determined by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) utilizing Alu1 and PstI restriction enzymes for alpha and beta gene products digestion, respectively. For analysis the genetic diversity of the sub allelic variants of Pvmsp3α and Pvmsp3β genes, Chi-Square test was performed by utilizing Minitab programming software 18. The P value 0.05 was considered as statistically significant. For Pvmsp 3α genes after gel electrophoresis of digested products, four distinct genotypes were obtained from total of 50 samples; type A: 35 (70%) (1.5-2.0 kb), 12 of type B (24%) (1.5-1.7 kb), 2 of type C (4%) (0.5-1.5) and one for type D (2%) (0.5-0.65 kb) which could be characterized into 9 allelic pattern (A1-A4, B1-B3, C1, D), in which A3 remained the most predominant. For Pvmsp-3βgenes, three distinct genotypes were obtained from 50 samples; 40(80%) of type A (1.5-2.5 kb), 9 (18%) of type B (1.0-1.5kb) and 1(2%) of type C (0.65 kb) which could be characterized into 6 allelic patterns (A1-A3, B1-B2, and C1). Most dominant one in Type A was A1 alleles which were noted (46%), while in Type B, the most dominant were B1 (10%).This study is the first ever report of molecular epidemiology and genetic variation in Pvmsp-3α and Pvmsp-3β genes of P. vivax isolates by using PCR/RFLP from District Mardan and [...].

O Plasmodium vivax é o parasita da malária humana mais comum nos países asiáticos, incluindo o Paquistão. O presente estudo foi desenhado para explorar a diversidade genética de genótipos de Plasmodium vivax baseados nos genes Pvmsp-3α e Pvmsp-3β, usando marcadores de ensaios alélicos nested PCR e RFLP de isolados de campo no distrito de Mardan, Paquistão. Amostras de sangue de 200 pacientes com malária por P. vivax foram coletadas após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. A diversidade genética em produtos de PCR nested foi determinada por polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP) utilizando as enzimas de restrição Alu1 e PstI para a digestão dos produtos dos genes alfa e beta, respectivamente. Para análise da diversidade genética das variantes subalélicas dos genes Pvmsp3α e Pvmsp3β, o teste Qui-quadrado foi realizado utilizando o software de programação Minitab 18. O valor P = 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para os genes Pvmsp 3α, após eletroforese em gel de produtos digeridos, quatro genótipos distintos foram obtidos de um total de 50 amostras; tipo A: 35 (70%) (1,5-2,0 kb), 12 do tipo B (24%) (1,5-1,7 kb), 2 do tipo C (4%) (0,5-1,5) e um para o tipo D (2%) (0,5-0,65 kb), que podem ser caracterizados em nove padrões alélicos (A1-A4, B1-B3, C1, D), em que A3 permaneceu como o mais predominante. Para Pvmsp-3βgenes, três genótipos distintos foram obtidos a partir de 50 amostras; 40 (80%) do tipo A (1,5-2,5 kb), 9 (18%) do tipo B (1,0-1,5 kb) e 1 (2%) do tipo C (0,65 kb), que podem ser caracterizados em seis padrões alélicos (A1-A3, B1-B2 e C1). Os mais dominantes no tipo A foram o alelo A1, observados em 46%, enquanto, no tipo B, os mais dominantes foram B1 (10%). Este estudo é o primeiro relato de epidemiologia molecular e variação genética em Pvmsp-3α. Os genes Pvmsp-3β de isolados de P. vivax utilizando PCR/RFLP do Distrito Mardan mostraram um nível notável de diversidade genética nos genes estudados [...].

Plasmodium vivax metacaspase 1 (PvMCA1) catalytic domain is conserved in field isolates from Brazilian Amazon

In the present study, we investigated the genetic diversity of Plasmodium vivax metacaspase 1 (PvMCA1) catalytic domain in two municipalities of the main malaria hotspot in Brazil, i.e., the Juruá Valley, and observed complete sequence identity among all P. vivax field isolates and the Sal-1 reference strain. Analysis of PvMCA1 catalytic domain in different P. vivax genomic sequences publicly available also revealed a high degree of conservation worldwide, with very few amino acid substitutions that were not related to putative histidine and cysteine catalytic residues, whose involvement with the active site of protease was herein predicted by molecular modeling. The genetic conservation presented by PvMCA1 may contribute to its eligibility as a druggable target candidate in vivax malaria.

Molecular variation of Plasmodium vivax dehydrofolate reductase in Mexico and Nicaragua contrasts with that occurring in South America / Variación molecular de la dehidrofolato reductasa de Plasmodium vivax en México y Nicaragua contrasta con la que ocurre en Sudamérica

Abstract: Objective: To research mutations associated to pyrimethamine resistance in dihydrofolate reductase (pvdhfr) of Plasmodium vivax from Mexico and Nicaragua and compare it to that reported in the rest of America. Materials and methods: Genomic DNA was obtained from P. vivax-infected blood samples. A pvdhfr gene fragment was amplified and sequenced. The identified gene variations were compared to those observed in other affected sites of America. Results: No mutations in pvdhfr were detected in P. vivax from Mexico and Nicaragua. One synonymous change and variation in the repeat domain was detected in Nicaraguan parasites. In South America, a high frequency of variant residues 58R and 117N associated to pyrimethamine resistance was reported. Conclusions: The lack of polymorphisms associated with pyrimethamine resistance suggests that drug-resistant P. vivax has not penetrated Mesoamerica, nor have local parasites been under selective pressure. These data contribute to establish the basis for the epidemiological surveillance of drug resistance.

Resumen: Objetivo: Determinar mutaciones en la dihydrofolato reductasa deP. vivax (Pvdhfr) en parásitos de México y Nicaragua, y comparar con lo reportado en América. Material y métodos: Del ADN de sangres infectadas con P. vivax de pacientes, el gen pvdhfr se amplifico y secuenció, y se contrastócon lo observado en América. Resultados: No se detectaron mutaciones asociadas con la resistencia debida a pirimetamina. Los parásitos de Nicaragua tuvieron una mutación sinónima y variación en la región repetida. Se reportaron frecuentes mutaciones asociadas con la resistencia a la pirimetamina en Sudamérica. Conclusiones: La ausencia de polimorfismos en Pvdhfr sugiere que no se han seleccionado ni introducido parásitos resistentes en la zona de estudio, lo que resulta muy útil para la vigilancia epidemiológica.

Avaliação das células B de memória na malária por Plasmodium vivax: contribuição no entendimento da imunidade humoral de longa duração

A invasão dos eritrócitos pelo parasito da malária garante o estabelecimento da infecção e é responsável pelos sintomas clínicos da doença. Dessa forma, existe um grande interesse no desenvolvimento de vacinas que possam induzir a produção de anticorpos com capacidade de bloquear a invasão dos eritrócitos e consequentemente interromper o ciclo biológico do parasito. No caso do Plasmodium vivax, a invasão do eritrócito é altamente dependente de uma proteína do complexo apical do parasito --Duffy binding protein II (DBPII)-- que reconhece o antígeno de grupo sanguíneo Duffy--DARC (Duffy Antigen Receptor for Chemokines) -- na superfície dos reticulócitos humanos. Embora a importância dos anticorpos na imunidade contra a malária esteja bem estabelecida, os fatores que estão diretamente envolvidos no mecanismo de desenvolvimento de células B de memória (MBCs) de longa duração são pouco conhecidos, o que faz-se necessário o conhecimento, especialmente para o desenvolvimento de uma vacina contra essa doença. No presente trabalho avaliamos a resposta imune adquirida contra o P. vivaxem uma população exposta uma única vez a esse parasito em um surto ocorrido na região metropolitana deMinas Gerais, após 12 anos da infecção

A persistência de anticorpos contra as proteínas de fase sanguínea de P. vivax(MSP1-19 e DBPII), além dos protótipos vacinais baseados em DBPII(DEKnull e DEKnull2) foram avaliados por sorologia convencional (ELISA). Foram avaliadas também, células B de memória (MBCs) específicas diferenciadas em células secretoras de anticorpos (ASCs) IgG+ e IgM+ foram avaliadas pelo ensaio de ELISpot. Além disso, no presente trabalho foram avaliadas as MBCs circulantes e anticorpos anti-P. vivax(MSP1-19, variantes e protótipos vacinais de DBPII) em residentes de área endêmica, com infecção aguda e não-aguda. Os resultados mostram que, embora os anticorpos produzidos após uma única e curta exposição ao P. vivax são de curta duração, uma vez que, anticorpos específicos não foram observados para nenhuma das proteínas avaliadas nesse trabalho após 12 anos da ocorrência do surto, as MBCs específicas aos antígenos de P. vivax ainda são detectadas.De forma interessante, o protótipo DEKnull2 apresentou alta imunogenicidade com 52% de produção de ASCs IgG+ em indivíduos expostos ao surto. Além disso, observamos que a resposta de MBCs IgM+ específica para DBPII e DEKnull2 foi mais robusta que a encontrada para MBCs IgG+. Com relação aos indivíduos de área endêmica podemos observar que o acúmulo de exposição ao P. vivax leva a expansão de MBCs atípicas. Este trabalho permitiu observar que uma única exposição ao P. vivax é capaz de induzir a produção de MBCs de longa duração contra a DBPII e seus protótipos, e que apenas a exposição contínua a esse parasito é capaz de levar ao aumento das MBCs atípicas

Whole-genome sequencing of a Plasmodium vivax isolate from the China-Myanmar border area

Currently, there is a trend of an increasing number of Plasmodium vivaxmalaria cases in China that are imported across its Southeast Asia border, especially in the China-Myanmar border area (CMB). To date, little is known about the genetic diversity of P. vivaxin this region. In this paper, we report the first genome sequencing of a P. vivaxisolate (CMB-1) from a vivax malaria patient in CMB. The sequencing data were aligned onto 96.43% of the P. vivaxSalvador I reference strain (Sal I) genome with 7.84-fold coverage as well as onto 98.32% of 14 Sal I chromosomes. Using the de novoassembly approach, we generated 8,541 scaffolds and assembled a total of 27.1 Mb of sequence into CMB-1 scaffolds. Furthermore, we identified all 295 known virgenes, which is the largest subtelomeric multigene family in malaria parasites. These results provide an important foundation for further research onP. vivaxpopulation genetics.

A sensitive, specific and reproducible real-time polymerase chain reaction method for detection of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum infection in field-collected anophelines

We describe a simple method for detection of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum infection in anophelines using a triplex TaqMan real-time polymerase chain reaction (PCR) assay (18S rRNA). We tested the assay on Anopheles darlingi and Anopheles stephensi colony mosquitoes fed with Plasmodium-infected blood meals and in duplicate on field collected An. darlingi. We compared the real-time PCR results of colony-infected and field collected An. darlingi, separately, to a conventional PCR method. We determined that a cytochrome b-PCR method was only 3.33% as sensitive and 93.38% as specific as our real-time PCR assay with field-collected samples. We demonstrate that this assay is sensitive, specific and reproducible.

Genetic diversity of chloroquine-resistant Plasmodium vivax parasites from the western Brazilian Amazon

The molecular basis of Plasmodium vivax chloroquine (CQ) resistance is still unknown. Elucidating the molecular background of parasites that are sensitive or resistant to CQ will help to identify and monitor the spread of resistance. By genotyping a panel of molecular markers, we demonstrate a similar genetic variability between in vitro CQ-resistant and sensitive phenotypes of P. vivax parasites. However, our studies identified two loci (MS8 and MSP1-B10) that could be used to discriminate between both CQ-susceptible phenotypes among P. vivax isolates in vitro. These preliminary data suggest that microsatellites may be used to identify and to monitor the spread of P. vivax-resistance around the world.

Caracterização molecular de Plasmodium vivax isolados de infecções primárias e recaídas e a influência da homeostase do ferro na ativação dos hipnozoítos / Molecular characterization of isolates of Plasmodium vivax primary infection and relapse and influence of iron homeostasis in the activation of hypnozoites

As hipóteses deste trabalho são a de que parasitos que causam recaídas são geneticamente homólogos aos parasitos das infecções primárias e que infecções múltiplas podem estar presentes nas infecções primárias e recaídas; Além dessas, outra hipótese é de que a hepcidina esteja envolvida no desenvolvimento de recaídas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi analisar a variabilidade genética de isolados de amostras pareadas infecção primária/recaídas de um mesmo paciente e investigar a associação entre a homeostase do ferro, particularmente da hepcidina e sua associação com a ativação dos hipnozoítos além de avaliar a resposta imunológica contra os principais antígenos do P. vivax. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientes foram genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares através de eletroforese capilar. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foi confirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados dos microssatélites e genotipagem a partir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foi demonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos em relação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelos predominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelos por marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentes episódios da doença num mesmo paciente...

A principal contribuição deste estudo foi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primárias como nas recaídas, sendo que infecções múltiplas puderam ser identificadas com um mínimo de Cinco marcadores.Foram feitas dosagens bioquímicas de ferro, ferritina, níveis de hepcidina e análise de outras variáveis como hemoglobina e parasitemia dos pacientes. Houve diferença significativa entre os grupos somente na análise de níveis de hemoglobina sendo maior nas recaídas. Acredita-se que o número de amostras foi um limitante das análises estatísticas. O gene codificador da hepcidina foi sequenciado nas amostras de área sem transmissão e de área endêmica. Não foram encontrado polimorfismos nesse gene mostrando seu alto grau de conservação. Não foi observada diferença nos níveis de resposta imunológica contra os antígenos do P. vivax nas infecções primárias e recaídas. As infecções por este parasito são observadas com alta diversidade genética e com a presença de múltiplas variantes em uma mesma infecção, sendo esta, primária ou recaída da doença, variantes que podem sofrer variações em sua frequência durante a evolução da doença. Com estes resultados espera-se contribuir para o esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitos e dos mecanismos que influenciam o desenvolvimento das recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento o tratamento e auxiliando no controle da doença...

Avaliação de marcadores moleculares na determinação da diversidade clonal nas infecções causadas por Plasmodium vivax / Evaluation of molecular markers to determine the clonal diversity in infections caused by Plasmodium vivax

A malária é causada por parasitos do gênero Plasmodium, sendo P. vivax a espécie mais amplamente distribuída no mundo. Em áreas endêmicas, é frequente a coinfecção em um mesmo indivíduo por diferentes variantes de P. vivax,caracterizando uma infecção múltipla. Nestas infecções, diferentes proporções das variantes podem ser relevantes na competição entre elas, na virulência e na resistência às drogas. O objetivo deste trabalho foi de avaliar a eficiência dos marcadores moleculares na identificação de infecções múltiplas por P.vivax. Desta forma, foram selecionados seis marcadores (MS06, MS07, MSP-3α, MSP-1B2,MSP-1B10 e MN21) caracterizados por polimorfismos de tamanho analisados por eletroforese capilar. Para cumprir este objetivo foram usadas três estratégias metodológicas. Inicialmente dois diferentes alelos amplificados de cada loci foram clonados em plasmídeos para o estabelecimento de infecções múltiplas artificiais...

Genetic Polymorphisms in VIR Genes among Indian Plasmodium vivax Populations

The vir genes are antigenic genes and are considered to be possible vaccine targets. Since India is highly endemic to Plasmodium vivax, we sequenced 5 different vir genes and investigated DNA sequence variations in 93 single-clonal P. vivax isolates. High variability was observed in all the 5 vir genes; the vir 1/9 gene was highly diverged across Indian populations. The patterns of genetic diversity do not follow geographical locations, as geographically distant populations were found to be genetically similar. The results in general present complex genetic diversity patterns in India, requiring further in-depth population genetic and functional studies.

Caracterização molecular de Plasmodium vivax isolados de infecções primárias e recaídas e a influência da homeostase do ferro na ativação dos hipnozoítos

As hipóteses deste trabalho são a de que parasitos que causam recaídas são geneticamente homólogos aos parasitos das infecções primárias e que infecções múltiplas podem estar presentes nas infecções primárias e recaídas; Além dessas, outra hipótese é de que a hepcidina esteja envolvida no desenvolvimento de recaídas. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi analisar a variabilidade genética de isolados de amostras pareadas infecção primária/recaídas de um mesmo paciente e investigar a associação entre a homeostase do ferro, particularmente da hepcidina e sua associação com a ativação dos hipnozoítos além de avaliar a resposta imunológica contra os principais antígenos do P. vivax. Sessenta e cinco amostras pareadas de 30 pacientes foram genotipadas utilizando 10 marcadores moleculares através de eletroforese capilar. Além disso, a presença de infecção múltipla nos pacientes foi confirmada através da clonagem dos fragmentos amplificados dos microssatélites e genotipagem a partir de diferentes colônias. Na análise baseada nos alelos predominantes foi demonstrado que os parasitos da recaída são principalmente heterólogos em relação à infecção primária e que geralmente ocorre uma flutuação entre os alelos predominantes nos diferentes episódios do indivíduo. Entretanto, o número de alelos por marcador foi limitado e geralmente os alelos foram idênticos nos diferentes episódios da doença num mesmo paciente.

A principal contribuição deste estudo foi demonstrar uma alta taxa de infecções múltiplas tanto das infecções primárias como nas recaídas, sendo que infecções múltiplas puderam ser identificadas com um mínimo de Cinco marcadores.Foram feitas dosagens bioquímicas de ferro, ferritina, níveis de hepcidina e análise de outras variáveis como hemoglobina e parasitemia dos pacientes. Houve diferença significativa entre os grupos somente na análise de níveis de hemoglobina sendo maior nas recaídas. Acredita-se que o número de amostras foi um limitante das análises estatísticas. O gene codificador da hepcidina foi sequenciado nas amostras de área sem transmissão e de área endêmica. Não foram encontrado polimorfismos nesse gene mostrando seu alto grau de conservação. Não foi observada diferença nos níveis de resposta imunológica contra os antígenos do P. vivax nas infecções primárias e recaídas. As infecções por este parasito são observadas com alta diversidade genética e com a presença de múltiplas variantes em uma mesma infecção, sendo esta, primária ou recaída da doença, variantes que podem sofrer variações em sua frequência durante a evolução da doença. Com estes resultados espera-se contribuir para o esclarecimento dos aspectos relacionados à diversidade genética dos parasitos e dos mecanismos que influenciam o desenvolvimento das recaídas do P. vivax, que poderão ajudar no seu prognóstico, direcionamento o tratamento e auxiliando no controle da doença.

Avaliação de marcadores moleculares na determinação da diversidade clonal nas infecções causadas por Plasmodium vivax

A malária é causada por parasitos do gênero Plasmodium, sendo P. vivax a espécie mais amplamente distribuída no mundo. Em áreas endêmicas, é frequente a coinfecção em um mesmo indivíduo por diferentes variantes de P. vivax,caracterizando uma infecção múltipla. Nestas infecções, diferentes proporções das variantes podem ser relevantes na competição entre elas, na virulência e na resistência às drogas. O objetivo deste trabalho foi de avaliar a eficiência dos marcadores moleculares na identificação de infecções múltiplas por P.vivax. Desta forma, foram selecionados seis marcadores (MS06, MS07, MSP-3α, MSP-1B2,MSP-1B10 e MN21) caracterizados por polimorfismos de tamanho analisados por eletroforese capilar. Para cumprir este objetivo foram usadas três estratégias metodológicas. Inicialmente dois diferentes alelos amplificados de cada loci foram clonados em plasmídeos para o estabelecimento de infecções múltiplas artificiais.

Na segunda estratégia foram realizadas misturas artificiais de DNAs de pacientes com parasitemia e níveis de leucócitos semelhantes. E por fim, realizou-se a genotipagem de isolados de P. vivax de 47 pacientes da Amazônia Brasileira, sendo 22 pacientes com infecção múltipla previamente identificada. Ao simularmos infecções múltiplas artificiais com diferentes proporções de cada clone ou DNA de paciente verificamos que: (1) para os MS e TR, alelos menores foram preferencialmente amplificados por PCR; (2) para ambos os blocos da MSP-1,ocorreu titulação nos resultados; (3) para MSP-3α não houve amplificação preferencial do alelo menor; (4) a utilização do critério de altura mínima de » da do pico predominante para a detecção dos alelos raros foi mais eficiente na detecção da multiplicidade de infecção. Na genotipagem de isolados de campo os marcadores MS06, MS07, MSP-1B10, MSP-3α e MN21 foram suficientes para detecção de100% das infecções múltiplas em pacientes. Assim, estamos propondo um painel demarcadores neutros (MS06, MS07 e MN21) e não neutros (MSP-3α e MSP-1B10) na detecção de infecções múltiplas utilizando o critério menos estringente para detecção dos alelos raros.

Probability of Antibody Formation against Circumsporozoite Protein of Plasmodium vivax among Korean Malaria Patients

To evaluate the seroprevalence against circumsporozoite protein (CSP) of Plasmodium vivax in sera of Korean patients, the central repeating domain (CRD) of CSP was cloned and analyzed. From the genomic DNA of patient's blood, 2 kinds of CSPs were identified to belong to a VK210 type, which is the dominant repeating of GDRA(D/A)GQPA, and named as PvCSPA and PvCSPB. Recombinantly expressed his-tagged PvCSPA or PvCSPB in Escherichia coli reacted well against sera of patients in western blot, with the detecting rate of 47.9% (58/121), which included 15 cases positive for PvCSPA, 6 cases positive for PvCSPB, and 37 cases for both. The mixture of PvCSPA and PvCSPB was loaded to a rapid diagnostic test kit (RDT) and applied with the same set of patient sera, which resulted in detection rates of 57.0% (69/121). When the protein sequences of PvCSPA were compared with those of P. vivax in endemic regions of India and Uganda, they were compatibly homologous to PvCSPA with minor mutations. These results suggested that the recombinant PvCSPA and PvCSPB loaded RDT may be a milestone in latent diagnosis which has been a hot issue of domestic malaria and important for radical therapy in overlapped infections with P. falciparum in tropical and subtropical areas. During the biological process of malarial infection, exposure of CSP to antigen-antibody reaction up to 57.0% is the first report in Korea.

Evaluation of three different DNA extraction methods from blood samples collected in dried filter paper in Plasmodium subpatent infections from the Amazon region in Brazil / Avaliação de três métodos de extração de DNA obtidos de amostras de sangue coletadas em papel de filtro em infecções subpatentes de Plasmodium da região Amazônica no Brasil

Asymptomatic Plasmodium infection is a new challenge for public health in the American region. The polymerase chain reaction (PCR) is the best method for diagnosing subpatent parasitemias. In endemic areas, blood collection is hampered by geographical distances and deficient transport and storage conditions of the samples. Because DNA extraction from blood collected on filter paper is an efficient method for molecular studies in high parasitemic individuals, we investigated whether the technique could be an alternative for Plasmodium diagnosis among asymptomatic and pauciparasitemic subjects. In this report we compared three different methods (Chelex®-saponin, methanol and TRIS-EDTA) of DNA extraction from blood collected on filter paper from asymptomatic Plasmodium-infected individuals. Polymerase chain reaction assays for detection of Plasmodium species showed the best results when the Chelex®-saponin method was used. Even though the sensitivity of detection was approximately 66% and 31% for P. falciparum and P. vivax, respectively, this method did not show the effectiveness in DNA extraction required for molecular diagnosis of Plasmodium. The development of better methods for extracting DNA from blood collected on filter paper is important for the diagnosis of subpatent malarial infections in remote areas and would contribute to establishing the epidemiology of this form of infection.

Infecção assintomática por Plasmodium é um novo desafio para a saúde pública no Brasil. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é o melhor método para detectar baixas parasitemias presentes em pacientes com infecção assintomática. Nas áreas endêmicas, a coleta de sangue total é dificultada pela distancia geográfica, transporte e adequada armazenagem das amostras. A coleta de sangue em papel de filtro pode ser uma alternativa nessas áreas de difícil acesso. Neste estudo foram comparados três diferentes métodos de extração de ADN a partir de papel de filtro usando como controle extração a partir de sangue total. O protocolo Chelex®-Saponina foi o que obteve o melhor resultado quando comparado com os outros três protocolos. No entanto a sensibilidade foi de 66,7% para o P. falciparum e 31,6% para o P. vivax. Conclui-se que em caso de infecção assintomática o papel de filtro não é ainda uma boa alternativa para coleta de amostras.

Sequence polymorphisms in Pvs48/45 and Pvs47 gametocyte and gamete surface proteins in Plasmodium vivax isolated in Korea

Nucleotide sequence analyses of the Pvs48/45 and Pvs47 genes were conducted in 46 malaria patients from the Republic of Korea (ROK) (n = 40) and returning travellers from India (n = 3) and Indonesia (n = 3). The domain structures, which were based on cysteine residue position and secondary protein structure, were similar between Plasmodium vivax (Pvs48/45 and Pvs47) and Plasmodium falciparum (Pfs48/45 and Pfs47). In comparison to the Sal-1 reference strain (Pvs48/45, PVX_083235 and Pvs47, PVX_083240), Korean isolates revealed seven polymorphisms (E35K, H211N, K250N, D335Y, A376T, I380T and K418R) in Pvs48/45. These isolates could be divided into five haplotypes with the two major types having frequencies of 47.5% and 20%, respectivelfy. In Pvs47, 10 polymorphisms (F22L, F24L, K27E, D31N, V230I, M233I, E240D, I262T, I273M and A373V) were found and they could be divided into four haplotypes with one major type having a frequency of 75%. The Pvs48/45 isolates from India showed a unique amino acid substitution site (K26R). Compared to the Sal-1 and ROK isolates, the Pvs47 isolates from travellers returning from India and Indonesia had amino acid substitutions (S57T and I262K). The current data may contribute to the development of the malaria transmission-blocking vaccine in future clinical trials.

Seroepidemiología del paludismo en un grupo de migrantes en tránsito (Chiapas, 2008)

OBJETIVO: Conocer la prevalencia del paludismo y los factores asociados con la infección de migrantes en la frontera sur de México, durante 2008. MATERIAL Y MÉTODOS: En 706 migrantes, se investigó la infección activa mediante prueba rápida y PCR o pasada, mediante serología y se aplicó un cuestionario para investigar las condiciones asociadas con la infección. RESULTADOS: 85.6% provenía de Centroamérica. Ninguno presentó infección activa; 4.2% fue seropositivo y la mayoría provenía de los países con mayor incidencia de paludismo en la región. La seropositividad se asoció con el número de episodios previos de paludismo (RM=1.44; IC95% 1.04-2.00), años de permanencia en su comunidad de origen (RM=1.03; IC95% 1.00 -1.07) y conocimiento y automedicación con antipalúdicos (RM=3.38; IC95% 1.48-7.67). CONCLUSIONES: La exposición previa de migrantes al paludismo y las dificultades para su detección indican la necesidad de nuevas estrategias para la vigilancia epidemiológica para estas poblaciones.

OBJECTIVE: To know the prevalence of malaria and the factors associated with the infection in migrants in the southern border of Mexico, during 2008. MATERIALS AND METHODS: In 706 migrants, active malaria infection was investigated using a rapid diagnostic test and PCR and past infection using serology. A questionnaire was applied to investigate the conditions associated to infection. RESULTS: 85.6% originated from Central America, none presented an active infection, although 4.2% were seropositive, most of these came from the countries with the highest malaria incidence in the region. Seropositivity was associated with the number of previous malaria episodes (OR=1.44; IC95% 1.04-2.00), years living in their community of origin (OR=1.03; IC95% 1.00-1.07), and knowledge and self-medication with anti-malaria drugs (OR=3.38; IC95% 1.48-7.67). CONCLUSIONS:. The previous exposure of migrants and the difficulties for their detection indicate the need of new strategies for the epidemiological surveillance for these populations.

Malaria diagnosis from pooled blood samples: comparative analysis of real-time PCR, nested PCR and immunoassay as a platform for the molecular and serological diagnosis of malaria on a large-scale

Malaria diagnoses has traditionally been made using thick blood smears, but more sensitive and faster techniques are required to process large numbers of samples in clinical and epidemiological studies and in blood donor screening. Here, we evaluated molecular and serological tools to build a screening platform for pooled samples aimed at reducing both the time and the cost of these diagnoses. Positive and negative samples were analysed in individual and pooled experiments using real-time polymerase chain reaction (PCR), nested PCR and an immunochromatographic test. For the individual tests, 46/49 samples were positive by real-time PCR, 46/49 were positive by nested PCR and 32/46 were positive by immunochromatographic test. For the assays performed using pooled samples, 13/15 samples were positive by real-time PCR and nested PCR and 11/15 were positive by immunochromatographic test. These molecular methods demonstrated sensitivity and specificity for both the individual and pooled samples. Due to the advantages of the real-time PCR, such as the fast processing and the closed system, this method should be indicated as the first choice for use in large-scale diagnosis and the nested PCR should be used for species differentiation. However, additional field isolates should be tested to confirm the results achieved using cultured parasites and the serological test should only be adopted as a complementary method for malaria diagnosis.

Marcadores de inflamação na morbidade da malária por Plasmodium vivax: contribuição de micropartículas, ácidos nucléicos circulantes e polimorfismos genéticos do hospedeiro vertebrado / Markers of inflammation in the morbidity of Plasmodium vivax malaria: contribution of microparticles circulating nucleic acids and genetic polymorphisms of the vertebrate host

Os estudos sobre os mecanismos patogênicos que levam à malária grave foram durante muitos anos restritos basicamente ao Plasmodium falciparum. Entretanto, o número de casos de P. vivax vem aumentando em todo o mundo, incluindo aqueles de malária grave. Evidências recentes sugerem que a infecção pelo P. vivax induz uma resposta imune inflamatória mais intensa que aquela induzida pelo P. falciparum. Diante disso, os objetivos deste trabalho foram: (i) investigar mediadores plasmáticos relacionados à inflamação que poderiam ser utilizados como marcadores de morbidade da malária por P. vivax; (ii) identificar indivíduos geneticamente susceptíveis e/ou resistentes à malária clínica. Na busca de biomarcadores, a hipótese investigada foi a de que as micropartículas (MPs) – vesículas resultantes da ativação e/ou apoptose celular – e os ácidos nucléicos circulantes (CNAs) estariam associados à infecção pelo P. vivax. Em pacientes bem caracterizados clinicamente foi possível demonstrar que as MPs, de diferentes origens, estavam significativamente aumentadas na malária por P. vivax, sendo as MPs de origem plaquetária associadas à sintomatologia da doença. Os níveis de CNAs plasmáticos estavam aumentados nos pacientes infectados pelo P. vivax sendo estes níveis associados ao espectro clínico da doença. Um achado interessante no presente trabalho foi que os níveis de CNAs também correlacionaram- se com a trombocitopenia. Um resultado de grande importância foi que os níveis de MPs e CNAs no plasma retornaram aos valores basais após o tratamento antimalárico específico, o que sugere que ambos os fatores podem ser bons marcadores de morbidade por P. vivax.Na segunda parte do estudo, buscou- se a associação entre os polimorfismos genéticos de citocinas (MIF, TNF-α, IL-10 e TGF-β) e de glicoproteínas plaquetárias (GPIa/IIa e GPIIb/IIIa) com as complicações clínicas e hematológicas da infecção pelo P. vivax. Os resultados obtidos evidenciaram associações entre os polimorfismos dos genes GPIa/IIa, TNF-α, MIF e IL-10 e alterações clínicas e hematológicas na malária causada pelo P. vivax. Em resumo, os dados apresentados reforçam a influência de múltiplos genes do hospedeiro vertebrado na malária por P. vivax. Espera-se que os resultados observados no presente trabalho possam contribuir no esclarecimento dos mecanismos envolvidos na patogenia do P. vivax.